Őssejtek-e az embrionális őssejtek?
A kutatás harminc éve
A blasztomerek tovább osztódnak, kompaktizálódik az embrió, és kialakul a hólyagcsíra (blasztociszta). A blasztociszta állapotú embriókban már jól elkülöníthető a belső embriócsomó (inner cell mass, ICM), és az azt körülvevő ún. trofektoderma-réteg (1. ábra). Az embriócsomót alkotó őssejtek pluripotensek, vagyis képesek a kifejlett egyed összes testi sejtjének és ivarsejtjeinek kialakítására is, míg az extraembrionális szövetek a trofektoderma-sejtekből jönnek létre.
Eddig tehát láttuk, hogy vannak totipotens és pluripotens őssejtek, melyek különböző differenciációs állapotot képviselnek (2. ábra). Tudjuk azonban, hogy nemcsak az embrióban találhatóak őssejtek, hanem a felnőtt szervezet különböző szöveteiben is, melyek a csíralemezek szétválásakor keletkeznek, és az egyed egész élete folyamán megmaradnak. Ezek az ún. multipotens őssejtek, melyek már kisebb differeciációs potenciállal rendelkeznek, vagyis bizonyos mértékben már elköteleződtek valamilyen irányba, azaz még mindig többféle sejttípus jöhet létre belőlük, de már nem akármilyen. Ilyen multipotens őssejtek például a vérképző (hematopoietikus) őssejtek, melyek a csontvelőben találhatóak, továbbá ilyenek a szinte minden szervünkben megtalálható mesenchymalis őssejtek is. A felnőtt vagy szöveti őssejtjeink jótékony munkáját nap mint nap tapasztaljuk. Ezek felelősek azon sejtjeink pótlásáért, melyeket napi életünk során elhasználunk. Ilyenek a bőrünkben található őssejtek, melyek a hámsérülés során elpusztult sejteket pótolják, vagy a vérképző őssejtek, melyek gyakorlatilag folyamatosan képesek megújítani a vérünkben található sejteket. Ezért van az, hogy bizonyos mértékű vérveszteséget a szervezetünk magától képes pótolni. Beláthatjuk tehát, hogy az őssejtek mind előfordulásukat, mind funkciójukat tekintve igen sokfélék.
Az embrionális őssejtkutatás harminc éve
A legnagyobb érdeklődés, ugyanakkor a legnagyobb misztérium is az embrionális őssejteket övezi, mivel ez az őssejttípus az, melynek később talán a legnagyobb szerepe lehet a regeneratív orvoslásban, bár vizsgálatuk egyelőre inkább az alapkutatások körébe tartozik.
A legfontosabb különbség egy embrionális őssejt és egy testi sejt között az, hogy az embrionális őssejt korlátlan ideig differenciálatlan állapotban tud maradni, önmegújulásra képes, és pluripotens, vagyis mindhárom embrionális csíralemez sejtjeinek kialakítására képes, és hozzájárul a magzat véglegesen differenciálódott sejtjeinek, így az ivarsejtjeinek kialakításához is.
Több mint 30 évvel ezelőtt számoltak be először arról, hogy egér blasztociszta belső embriócsomójából nyert sejtekből sikerült embrionális őssejt-vonalat alapítani. Ezután majdnem két évtized telt el, mire emberi (mesterséges megtermékenyítés során megmaradt) embrióból is sikerült embrionális őssejt-vonalat létrehozni. Ezen kezdeti, blasztocisztából létrehozott sejtvonalak alapítása óta, mára már egér és ember esetében is rendelkezésre állnak néhány-sejtes embrióból létrehozott sejtvonalak is.
Bár rágcsálókból és főemlősökből már sikeresen alapítottak embrionális őssejt-vonalakat, más emlősállatok esetében ez még mindig nem sikerült. Ahhoz, hogy gazdasági haszonállatokból valódi embrionális őssejt-vonalakat alapíthassunk, muszáj tisztáznunk néhány alapvető kérdést. Ismernünk kell a meglévő embrionális őssejt-vonalak közti különbségeket, a beágyazódás előtti embriófejlődés menetét, a sejtek pluripotenciájának kialakításában és megtartásában résztvevő jelátviteli útvonalakat, valamint a sejtek optimális tenyésztési körülményeit.
A pluripotens sejtek jellemzői
A valódi embrionális őssejt-vonalakban lévő sejteknek rendelkezniük kell bizonyos speciális tulajdonságokkal, melyek elkülönítik őket a szövetspecifikus (multipotens) őssejtektől, és a véglegesen differenciálódott sejtektől. Legfontosabb, hogy az embrionális őssejtek korlátlan osztódásra képesek, és korlátlan ideig képesek megtartani differenciálatlan állapotukat, habár fontos megjegyezni, hogy az optimálistól eltérő körülmények között spontán eldifferenciálódhatnak. Ezen kívül, az embrionális őssejteket visszajuttatva az embrióba, képesek bekapcsolódni a normális embrionális fejlődés menetébe, mindhárom embrionális csíralemez sejtjeinek kialakítására képesek lesznek, így ivarsejtek is létrejöhetnek belőlük. A mesterségesen, tenyészetben fenntartott sejtvonalunk sejtjeiről elmondhatjuk, hogy valóban pluripotensek, amennyiben:
– in vitro körülmények között embriócsomókat (EB) hoznak létre;
– legyengített immunrendszerű állatba beültetve teratómát képeznek;
– kiméra utódok létrehozására képesek, bizonyítva, hogy az embrionális őssejtek részt vesznek az endo-, ekto-, és mezoderma szöveteinek kialakításában, és ivarsejtek létrehozására is képesek;
– a tetraploid komplemetáció során képesek a teljes embrió kialakítására.
Érdekes módon, csak a korai egér-blasztocisztából származó pluripotens őssejtek, illetve bizonyos indukált pluripotens őssejtek felelnek meg az ös.szes kritériumnak.
Az embrionális őssejt-technológia jelentősége
Az embrionális őssejteket a már említett különleges tulajdonságaik teszik a haszonállatokon alkalmazott mezőgazdasági, és orvos-biológiai módszerek felbecsülhetetlen eszközévé. Mezőgazdasági szempontból, az embrionális őssejt értékes génsebészeti eszköz lehet az állatállomány előnyös génekkel való javításához. Ennek egyrészt gazdasági jelentősége van, másrészt a betegségekkel szembeni ellenállás szempontjából is fontos. Nagy szerepe lehet a génmegőrzés területén is, továbbá az embrionális őssejtek jól használhatók az emlősök funkcionális genomikai kutatásaihoz is.
Orvos-biológiai szempontból is nagy jelenősége van a megfelelő őssejt-vonalak alapításának, hiszen ezek segítségével hatékonyan hozhatunk lére olyan modellállatokat, melyek segítségünkre lehetnek egyes humán betegségek vizsgálatában, illetve ezek kezelésében és gyógyításában.
A patásokból származó őssejt-technológia története
Kevesebb, mint egy évtizeddel az egér embrionális őssejt-vonalak alapítása után, in vitro termékenyített sertés blasztocisztából is sikerült sejtvonalakat alapítani. Ezek a sertés embrionális őssejtnek vélt sejtek azonban képtelenek voltak néhány passzázsnál tovább megtartani az embrionális őssejt-jellegű állapotot, amely arra enged következtetni, hogy nem valódi embrionális őssejtek voltak. Ekkor merült fel először a kérdés, hogy ezek a sejtek pluripotensnek tekinthetők-e. Újabb tanulmányok már szarvasmarha, sertés, kecske, és juh in vivo és in vitro termékenyített embrióból származó embrionális-, vagyis inkább embrionális-jellegű őssejt-vonalakról is beszámoltak. Az egérrel és a főemlősökkel szemben, a patásokból származó embrionális őssejtek esetében nem sikerült döntően bizonyítani, hogy folyamatosan osztódnak és differenciálatlan állapotban maradnak, valamint, hogy akár in vitro, akár in vivo képesek lennének mindhárom csíralemez sejtjeivé differenciálódni. Bár arról már beszámoltak, hogy kimérát képeznek, de ezekben az esetekben az embrionális őssejteredetű szövetek csak nagyon kis százalékban voltak kimutathatóak. A patások embriócsomójából származó sejtek biztos, hogy pluripotensek, mivel új utód szöveteinek létrehozására képesek. Mivel azonban a korai embrionális fejlődést irányító faktorokról rendelkezésre álló tudásunk jelenleg még elenyésző, így nem tudjuk megmondani, hogy az embrionális fejlődés során melyik az az optimális időpont, amikor a valóban pluripotens sejteket izolálhatjuk. Ennek az ismeretnek a hiányában nem lehet „valódi” embrionális őssejt-vonalat létrehozni. Ez a probléma nem egyedül a patásoknál létezik, mivel a sejtvonal-alapítás sikeressége rágcsálók esetében is függ a genetikai háttértől. Haszonállatok esetében rengeteg a még tisztázandó kérdés:
– Az embrionális őssejtet meghatározó morfológiai és/vagy fiziológiai jellegzetességek összefüggésben vannak-e a pluripotens jelleggel?
– Melyik a legjobb időszak az embriócsomó izolálására?
– Milyen faktorok határozzák meg a pluripotenciát a patások embrionális őssejtjeiben?
– Milyen faktorokat kell tartalmaznia a tenyésztő médiumnak az embrionális őssejtek pluripotenciájának és önmegújító képességének fenntartására?
Cikkünk következő részében azt mutatjuk be, hogy napjainkban meddig jutottunk ezen kérdések a megválaszolásával.
Embrionális őssejt-e egy embrionális őssejt?
Míg az egér embrionális őssejteket in vivo termékenyített (majd a méhből kimosott) embriókból hozták létre, addig a humán embrionális őssejt-vonalakat az IVF (in vitro fertilisation) klinikákon, mesterséges megtermékenyítéssel létrehozott, de fel nem használt, kutatási célokra felajánlott embriók epiblasztjából alapították (3. ábra).
Eddig az egér embrionális őssejtekből létrehozott sejtvonal az egyetlen olyan őssejt-vonal, mely a pluripotencia mind a négy kritériumának megfelel. Jelenleg úgy gondoljuk, hogy ez annak köszönhető, hogy az egér embrionális őssejtek egy korábbi fejlődési állapotot képviselnek, ezeket „naiv” embrionális őssejteknek nevezzük. Ezeket a sejteket LIF (leukémia inhibitor faktor, LIF) hozzáadása mellett tenyésztjük. Ezzel ellentétben, az egér embrionális csírakorongjának sejtjei már differenciálódottabb állapotban vannak, osztódásuk fenntartásához más növekedési faktorra, a bFGF-re van szükség. Ezek a sejtek ivarsejt kiméra létrehozására nem alkalmasak, ezeket „primed”, más néven „érett” állapotban levő embrionális őssejteknek nevezzük. Egérsejtek esetében, ha a sejtek osztódását segítik, illetve inhibitormolekulák hozzáadásával (2i) a differenciálódást gátolják, a sejtek folyamatosan osztódó „alapállapotba” kerülhetnek. Ez az állapot elsősorban a sejtciklus G1 fázisban lévő sejtek arányával jellemezhető, mivel minél hosszabb idejű egy sejt esetében a G1 fázisban töltött idő, annál nagyobb az esélye annak, hogy a sejtek differenciálódni kezdenek (4. ábra).
Az alapján, hogy az egér epiblaszt-sejtvonalak sejtjei, és a humán embrionális őssejtek ennyire hasonlítanak egymásra, feltételezhető, hogy ezen humán sejtek a „primed” állapotú őssejteknek feleltethetők meg, míg a patások embrionális fejlődése lényegesen eltér ezekétől, ami azt sejteti, hogy a sejtvonal-alapítás kezdetekor talán más fejlődési állapotú embrióból kellene kiindulni.
Ezek egyelőre megválaszolatlan kérdések, ismeretük azonban nagyon fontos lenne a valódi pluripotens őssejt-vonalak sikeres létrehozásához.
Az elsődleges sejtkultúrák létrehozása
A haszonállatokból való embrionális őssejt-vonalak alapításakor az egyik alapvető tanácstalanságot az okozza, hogy jelenleg nem tudjuk, mi lehet a megfelelő stádium az embrió izolálásához. Napjainkban elsősorban a korai blasztocisztát használják, de vannak, akik korábbi fejlődési állapotban lévő embriókból próbálnak embrionális őssejteket izolálni, melyek még valószínűleg „naiv” blasztomereket tartalmaznak. Egyre több közlemény jelenik meg arról is, hogy a fejlődő patásembriókban, az egér, illetve a humán embrióktól eltérő génexpressziós mintázatot találtak. Ez a különbség lehet az oka annak, hogy gazdasági haszonállatokból még nem tudtak „naiv” embrionális őssejt-vonalakat létrehozni, így át kell gondolnunk a sejtvonal alapításakor alkalmazott módszereket.
Patásokban ez olyan, mint a klasszikus „tyúk vagy a tojás” rejtély. Mivel nincs elfogadott standard patás embrionális őssejt, és sok következetlenség van az eddig leírt markereket illetően, a „valódi” patás embrionális őssejtek mibenléte még nem tisztázott. Ahhoz, hogy tisztábban lássunk ezen a területen, egyre fontosabb az embrióban található pluripotens sejtek jellemzése és az újonnan alapított pluripotens sejtvonalak sejtfelszíni markereinek összehasonlítása. Az intézetünkben folyó nyúl embrionális és iPS-sejtvonal alapítási munka során is egyre nagyobb hangsúlyt fektetetünk a nyúlembriók fejlődésének vizsgálatára, és az embrionális fejlődés során szerepet játszó pluripotenciát meghatározó faktorok megismerésére (5. ábra).
A legnehezebb feladat, hogy in vitro olyan körülményeket teremtsünk, amelyben az őssejtek megtartják differenciálatlan állapotukat, és képesek maradnak az önmegújulásra. További problémát jelent a sejtvonal alapításakor alkalmazandó tápláló sejtréteg megválasztása, illetve a tápláló sejtek mennyiségének meghatározása. Valószínűleg ebben a munkában is sokat segíthet majd az indukált pluripotens őssejtek (iPS-sejtek) létrehozása, illetve fenntartása során szerzett ismeret.
Mit tanulhatunk az iPS-sejtektől?
A „naiv” állapotú patás embrionális őssejtek létrehozása az utóbbi két évtizedben tehát végig sikertelen maradt. E tekintetben előrelépést jelenthet az, hogy gazdasági haszonállatok esetében is sikerült iPS-sejteket létrehozni. A kezdeti mérföldkövet Takahasi és Yamanaka publikációja adta, melyben egérből származó szomatikus sejteket programoztak vissza embrionális-jellegű, úgynevezett iPS-sejtekké, négy transzkripciós faktor (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) túlexpresszáltatásával. Az egér iPS-sejteknek megvannak az embrionális őssejtekre jellemző alapvető tulajdonságai, vagyis teratómát képeznek, és ivarsejtkiméra-utódokat is létrehoznak. Azóta elfogadottá vált ez a technika, és sok más fajból is sikerült iPS-sejttenyészeteket létrehozni. Ám számos megválaszolandó kérdés van még ezzel kapcsolatban, és egyre inkább úgy tűnik, hogy az iPS-sejtek nem minden tekintetben azonosak a valódi embrionális őssejtekkel.
Az utóbbi évek tanulmányai azt mutatják, hogy a sertés iPS-sejtek kevésbé az egér, mint inkább a humán embrionális őssejtekre hasonlítanak. Ez is azt mutatja, hogy sertésekben a ma rendelkezésre álló pluripotens sejtek alapvetően „primed” állapotúak lehetnek. Néhány egértörzstől eltekintve, ugyanez igaz a többi emlősfajra is. Meg kell jegyezni, hogy a kis molekulák előre törése, melyeket target-specifikusan, a pluripotens állapot fenntartásához szükséges jelátviteli útvonalak befolyásolásához használnak, valamint a visszaprogramozó gének széles tárhaza lehetővé tette új, „naiv” iPS-sejtek létrehozását. Bár az ilyen sejtvonalakban rejlő lehetőségek még feltérképezés alatt állnak, ezeknek a tanulmányoknak az ismeretében kijelenthető, hogy az embrionális őssejt-, és az iPS-technológia egymást kölcsönösen segítve hamarosan a gyógyászatban is alkalmazható eredményeket érhet el.
Bár az iPS-sejtek felhasználása széleskörű alkalmazási lehetőséget ígér, létrehozásuk körül még mindig sok probléma vetődik fel. Az egyik, hogy még ma is sok esetben beépülő retrovírus vektorokat használnak ahhoz, hogy az átprogramozott sejtekben folyamatosan expresszálódjon a transzgén. Ez a mutagenezis kockázatán felül, a pluripotencia gének folyamatos expresszióját is eredményezi, ami ezzel párhuzamosan az iPS-sejtek differenciálódási képességét is korlátozza. Az iPS-sejtek biztonságosabb alkalmazásának elősegítése érdekében indukálható vektorokat kell alkalmazni, és a bevitt transzgént ki kell vágni a létrehozott iPS-sejtekből. A másik lehetőség, hogy a visszaprogramozást nem-beépülő vektorokkal végzik, ún. „őssejt-fehérjék” használatával, vagy kis molekulák kombinációjával. Megállapítható, hogy minden lehetséges buktatója ellenére, az iPS-technológia valós esélyt jelent arra, hogy a közeljövőben a gazdasági haszonálla tok esetében is létre tudjunk majd hozni pluripotens embrionális őssejt-vonalakat. Az iPS-sejtek létrehozására szolgáló technológia fejlődésével ki lehet alakítani egy olyan módszert, mely esetében nem lesz szükséges az átprogramozó faktor beépülése, ezzel biztonságosan alkalmazható embrionális őssejt-vonalakat lehet majd létrehozni gazdasági haszonállatok, illetve a kihalással veszélyeztetett fajok esetében is.
Irodalom
Bauer BK, Isom SC, Spate LD, Whitworth KM, Spollen WG, Blake SM, Springer GK, Murphy CN, Prather RS, 2010: Transcriptional profiling by deep sequencing identifies differences in mRNA transcript abundance in in vivo-derived versus in vitro-cultured porcine blastocyst stage embryos. Biol Reprod 83, 791–798.
Coronado D1, Godet M, Bourillot PY, Tapponnier Y, Bernat A, Petit M, Afanassieff M, Markossian S, Malashicheva A, Iacone R, Anastassiadis K, Savatier P, 2013: A short G1 phase is an intrinsic determinant of naïve embryonic stem cell pluripotency. Stem Cell Res ;10(1):118-31. doi: 10.1016/j.scr.2012.10.004. Epub 2012 Oct 29.
Evans MJ, Kaufman MH, 1981: Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292, 154–156.
Kang L, Wang J, Zhang Y, Kou Z, Gao S, 2009: iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocystcomplemented embryos. Cell Stem Cell 5, 135–138.
Maraghechi P, Hiripi L, Tóth G, Bontovics B, Bősze Zs, Gócza E, 2013: Discovery of pluripotency- associated microRNAs in rabbit preimplantation embryos and embryonic stem-like cells. Reprod 145, 421-437.
Martin GR, 1981: Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78, 7634–7638.
Morris SA, Graham SJ, Jedrusik A, Zernicka- Goetz M, 2013: The differential response to Fgf signalling in cells internalized at different times influences lineage segregation in preimplantation mouse embryos. Open Biol. 3(11):130104.
Nagy A, Rossant J, Nagy R, AbramowNewerly W, Roder JC, 1993: Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage ESCs. Proc Natl Acad Sci USA 90, 8424–8428.
Nichols J, Smith A, 2009: Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell 4, 487–492.
Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S, 2008: Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 322, 949–953.
Takahashi K, Yamanaka S, 2006: Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-76.
Telugu BP, Ezashi T, Roberts RM, 2010: Porcine induced pluripotent stem cells analogous to naive and primed embryonic stem cells of the mouse. Int J Dev Biol 54, 1703–1711.
Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jo- nes JM, 1998: ESC lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145–1147.
Wenceslau CV, Kerkis I, Lizier NF, Kerkis A, 2013: De-Differentiation of Somatic Cells to a Pluripotent State, Pluripotent Stem Cells, Dr. Deepa Bhartiya (Ed.), ISBN: 978-953-51-1192- 4, InTech
Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA, 2009: Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324, 797–801.
Zhao XY, Li W, Lv Z, Liu L, Tong M, Hai T, Hao J, Guo CL, Ma QW, Wang L, Zeng F, Zhou Q, 2009: iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature 461, 86–90.
Zhou H, Wu S, Joo JY, Zhu S, Han DW, Lin T, Trauger S, Bien G, Yao S, Zhu Y, Siuzdak G, Scholer HR, Duan L, Ding S, 2009: Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell 4, 581–584.
| Természet Világa, | 145. évfolyam, 9. szám,
2014. szeptember
https://www.termvil.hu/ |