MEZŐ GÁBOR−KISS KRISZTINA−BIRI-KOVÁCS BEÁTA−OLÁHNÉ SZABÓ RITA

Személyre szabott rákgyógyítás

 
    A daganatos megbetegedések okozta halálozások száma Magyarországon a korábbi növekvő tendencia után 2013 óta stagnál, valamivel kevesebb, mint 32 800 eset/év. Ez akár jónak is mondható, ha azt vesszük figyelembe, hogy a megbetegedések száma közben növekszik. A gyógyulásra való esély növekedésének okai az egyre jobb diagnosztikai és terápiás lehetőségek. Azonban elégedettségre nem lehet okunk, mert még mindig nálunk figyelhető meg az egyik legrosszabb statisztika ezen a területen Európában. Ezért nagyon fontos, hogy a tumorterápiával kapcsolatos kutatások megkülönböztetett figyelmet és támogatást kapjanak Magyarországon is. Különösen a magas mortalitású tumorok esetén lenne szükség nagy áttörést hozó új eredményekre. Daganatos megbetegedések közé tartoznak a tüdő- és légzőszervi tumorok, a vastagbél és az emésztőrendszer rosszindulatú daganatai, az emlő- és hasnyálmirigy-tumorok. Az emlőtumorok, ha időben diagnosztizálják azokat, elég jól gyógyíthatóak, és az esetek több mint kétharmadában teljes gyógyu­lás vagy 5 évnél hosszabb túlélés érhető el. Ebben az esetben a nagy esetszám miatt jelentős a halálozások száma. A másik véglet a hasnyálmirigy rosszindulatú daganata, amely ugyan kis esetszámban fordul elő, de a legpusztítóbb rákfajta, csupán az esetek 5%-ában lehet öt évnél hosszabb túlélést elérni.

Hatóanyag - irányító molekula-konjugátumok

1. ábra. A három vegyülettár (hatóanyag, linker, irányító molekula) és a belőlük felépíthető konjugátumok vázlatos képe. A komponensek számának növelésével a variációs lehetőségek száma jelentős mértékben nő

Kutatócsoportunk arra vállalkozott, hogy három olyan vegyülettárat állít elő (1. tumorellenes hatóanyagok; 2. irányító molekulák; 3. az előző kettőt összekapcsoló bifunkciós linkerek), amelyek nagy variabilitással kapcsolhatók egymáshoz, így akár 100 különböző gyógyszerjelölt molekulát is könnyen elő lehet állítani. Ezek a gyógyszerjelöltek alkalmasak lehetnek a magas mortalitású tumorok hatékony, személyre szabott, célzott terápiájára.
    Mit takar a személyre szabott célzott tumorterápia? A módszer, amelyet célzott vagy irányított daganatterápiának neveznek, azon alapszik, hogy olyan anyagokkal támadják a ráksejteket, amelyek nagy szelektivitással ismerik fel a beteg sejteket. Ezzel az eljárással az egészséges szövetek megkímélhetőek, csökkentve a terápia káros mellékhatásait és javítva a paciens életminőségét a kezelés alatt. Ez nagy előrelépés lenne a jelenleg alkalmazott kemoterápiás eljárásokhoz képest, ahol a gyógyszermolekulák bejuthatnak nemcsak a ráksejtekbe, hanem az egészséges sejtekbe is, amelyekre szintén toxikus hatásúak. Természetesen ahhoz, hogy ezt a terápiát hatékonyan lehessen alkalmazni, ismerni kell az adott daganaton azokat a molekulákat (pl. receptorokat), amelyek támadhatók a rák elpusztításának reményében. Ezeket a molekulákat a daganat eltávolítása, vagy biopsziás szövettani mintavétel után speciális vizsgálatokkal határozzák meg. Azt is érdemes hangsúlyozni, hogy egy szervtípus (pl. tüdő, hasnyálmirigy) rákos megbetegedésekor sem biztos, hogy azonos tumorról beszélünk. A különböző tumortípusok esetén pedig más-más gyógyszerre lehet szükség. Leegyszerűsítve, két különböző hasnyálmirigytumor-sejt (pl. Panc-1 és MiaPaca2) más-más receptorkészlettel rendelkezhet, tehát más-más irányító molekulák lesznek alkalmasak arra, hogy a kiválasztott és az adott sejten hatásos hatóanyagot, amelyek szintén lehetnek különbözőek, célba juttassa. Ahogy azt a 2011-ben megjelent cikkünkben bemutattuk, a sejtfelszíni receptorokon keresztül történő gyógyszer célba juttatásának hatékonyságát korlátozhatja az, hogy a ráksejteken a receptorok száma limitált. Ezért a vegyület koncentrációjának növelése nem feltétlenül vezet a hatékonyság növekedéséhez. Megoldás lehet, ha a daganatellenes szereket különböző irányító molekulákhoz kapcsoljuk, amelyek eltérő receptorokat ismernek fel a ráksejteken. Az így előállított vegyületek kombinációban történő alkalmazásával – a kapcsolt hatóanyagoktól függően – a komponensek hatása összeadódhat (additív hatás) vagy még erősíthetik is egymás hatását (szinergista hatás) a daganat elpusztításában. Ez az eljárás is azt feltételezi, hogy sokféle hatóanyag irányító molekula kombinációjára lehet szükség. Reményeink szerint az előállítandó vegyületkönyvtárak alkalmasak lesznek arra is, hogy ne csak különböző ráktípusokra fejlesszünk ki hatóanyagot irányító molekula-konjugátumokat, hanem egy azon daganattípusra több hatékony vegyületet is készíthessünk az adott elemekből (1. ábra).
    Eddig főleg a rák elpusztítására alkalmas hatóanyagról, illetve az azt célba juttatni képes, a daganatsejteken lévő receptorokat felismerő, és azokhoz kötődni képes irányító molekulákról volt szó. Nagyon fontos szerepe van azonban a két komponenst összekötő bifunkciós linkernek, az összekötő elemnek is. Ennek biztosítania kell, hogy a kialakított konjugátum stabil maradjon addig, amíg a vegyület eljut a célzott ráksejtekhez, de bejutva a sejtekbe, a hatóanyag vagy annak aktív metabolitja fel tudjon szabadulni a konjugátumból. Ez szükséges általában ahhoz, hogy a gyógyszer kifejthesse tumort pusztító hatását. Mindehhez az szükséges, hogy mind a hatóanyagon, mind az irányító molekulán legyen olyan, lehetőleg egymástól eltérő típusú funkciós csoport, amelyik a linker kétfunkciós csoportjához külön-külön és szelektíven, kovalens kémiai kötés kialakítása során kapcsolódni tud. A különböző komponensek közötti kapcsolatról azt érdemes megemlíteni, hogy míg az irányító molekula és a linker közötti kötésnek nem kell bomlania, így akár egy nagyon stabil kötés (pl. tioéter-kötés) is lehet, addig a linker és a hatóanyag közötti kötést célszerű úgy kialakítani, hogy a szabad hatóanyag vagy annak aktív metabolitja felszabaduljon a ráksejtekben.
    Bár, mint azt látjuk, a konjugátum mindhárom komponense igen fontos szerepet tölt be a hatóanyag célba juttatásában, és így nem érdemes a hatás szempontjából kiemelni egyiket sem, talán mégis egy kicsit megkülönböztetett jelentősége van az irányító molekulának, hisz ez az egység fogja eredményezni a konjugátum tumor-specifikusságát, ami kezelés során a gyógyszer mellékhatásainak csökkenését okozza. Ahogy említettük, ezek az irányító molekulák a ráksejteken a szelektíven vagy nagy mennyiségben előforduló receptorokat ismerik fel. Ezen receptorok és a hozzájuk kötődni képes ligandumok (pl. peptid hormonok) közül már sok ismert és folynak is kutatások velük a célzott tumorterápia területén. Korábban e folyóirat hasábjain már bemutattuk az ezen a területen a gonadotropin-releasing hormon (GnRH) analógjainak felhasználásával elért eredményeinket. Azonban érdemes újabb irányító molekulákat is keresni, amelyek vagy más ráksejteket ismernek fel, vagy ugyanazon daganatsejtek más receptorait, és így alkalmasak lehetnek a kombinált célzott terápiára. Az utóbbi időben egyre elterjedtebben használják ilyen célpontok és ligandumaik feltérképezésére az irányított evolúció egyik fajtáját, az úgynevezett fágbemutatásos technikát. Ennek a módszernek a nagyon leegyszerűsített vázlatát mutatja a 2. ábra.

2. ábra. A peptidszekvenciák kiválasztására alkalmas fágbemutatásos eljárás sematikus bemutatása

A bakteriofágok olyan vírusok, melyek baktériumokat támadnak meg. Szerkezetük igen egyszerű, egy külső fehérjeburokból és a benne található örökítő anyagból épülnek fel. Az eljárás lényege, hogy a vizsgálni kívánt peptidszekvenciákat kódoló gént a peptid kifejezésére használt bakteriofág génjéhez illesztik, így ez a peptidszakasz kifejeződik a bakteriofág burokfehérjéjében. Minden egyes fág egy peptidet fog kifejezni, és a fágban található örökítő anyag tartalmazni fogja az adott peptidet kódoló nukleinsavat. A felszínükön különböző peptideket megjelenítő fágok közül szelekciós eljárással lehet a legmegfelelőbbeket kiválasztani, ami általában kötődési teszten alapul. A fágok felszaporítása olyan baktériumtörzsekben történik, amiket a fág képes fertőzni. Ha egy hét aminosavból álló peptidet (heptapeptid) akarunk vizsgálni, figyelembe véve, hogy a 20 természetes fehérjeépítő aminosavat akarjuk beépíteni minden pozícióba, akkor 720 klónnal kell számolnunk, ami kb. 109 klónnak felel meg (ennyi féle heptapeptid állítható elő a 20 aminosav kombinációjából). Azonban a kiválasztást úgy tervezik, hogy minden fágtípusból több, általában 100–100 legyen kiinduláskor. Ezt a 1011 klónt tartalmazó keveréket hozzák össze a vizsgálni kívánt típusú tumorsejtekkel. Azok a klónok, amelyek olyan peptidszekvenciát tartalmaznak, amiket a ráksejteken lévő receptorok felismernek, azok (különböző erősséggel) kötődnek a sejtekhez, amelyek viszont nem kötődnek, azt lemossák a sejtekről. Ezután a kötődött klónokat leválasztják a sejtekről, ezeket felszaporítják baktériumsejtekben, majd egy új ciklusban újra összehozzák a sejtekkel. Ezt a kikötési és lemosási ciklust 3–5-ször megismétlik, így a jól kötődő peptidet tartalmazó klónok feldúsulnak a keverékben. Minél több ciklust végeznek, annál nagyobb valószínűséggel vannak jelen a jól kötődő tumorszelektív fágok a keverékben. Ezután a megmaradt fágokból random módon kiválasztanak kb. 50 klónt, és megfelelő módszerekkel (a fágban található örökítő anyagot szekvenálva) meghatározzák a nukleinsav-szekvenciát, amiből következtetni tudnak az aminosav-szekevnciára, jelen esetben a heptapeptid szekvenciájára, amely felismeri az adott típusú ráksejtet. Azonban a 3–5. szelekciós lépés után is több száz, esetleg több ezer különböző peptidet tartalmazó klón keveréke van jelen (a szelekciós lépések számának növekedésével ez a szám csökken). Az összes klónt természetesen nagyon időigényes és drága lenne végigvizsgálni. Ezért választanak ki limitált számú (pl. 50) klónt a vizsgálathoz. Ebből persze az következik, hogy lehet, hogy vannak a keverékben olyan peptideket tartalmazó klónok, amelyek még hatékonyabban kötődnek a ráksejtekhez, de a véletlenszerű kiválasztás miatt elveszítjük azokat. Mivel tehát nem biztos, hogy a legmegfelelőbb szekvenciákat találtuk meg a fágbemutatásos technikával, ezért a kiválasztott peptid szerkezetében történő változtatásokat érdemes tovább tanulmányozni.
    Általában az oligopeptidekben vannak olyan aminosavak, amelyek jelenléte fontos a receptorkötődés, vagy a megfelelő térszerkezet kialakítása szempontjából, így ezek megváltoztatása a hatás elvesztésével járhat. Más aminosavak azonban módosíthatók a hatás elvesztése nélkül, sőt bizonyos esetekben még fokozható is a biológiai aktivitás. Ahhoz, hogy megtaláljuk a cserélhető, illetve nem cserélhető aminosavakat a szekvenciában, a peptidkémikusok az úgynevezett alanin-szkennelési (Ala scan) módszert alkalmazzák. Ennek során a szekvencia minden pozíciójában egyenként alaninra cserélik az ott található aminosavat. Ezek után megvizsgálják, hogy az adott változtatás hatására miként változik a biológiai aktivitás. Ha azt tapasztalják, hogy a hatás csökken, vagy netalán meg is szűnik, akkor az azt jelenti, hogy azt az aminosavat nem célszerű változtatni. Ha azonban a módosítás hatására nem következik be hatáscsökkenés, esetleg hatásfokozódás tapasztalható, akkor az a pozíció változtatható. Következő lépésben az így megismert pozícióba más aminosavakat is kipróbálnak (pozíciós szkennelés), amely során fényt derítenek arra, hogy milyen karakterű aminosav (savas, bázikus, apoláris, poláris) beépítése szolgáltatja a leghatékonyabb vegyületet. Az alábbiakban egy, a laboratóriumunkban végzett kísérlet alapján mutatnánk be ezt a folyamatot.

3. ábra. A fágbemutatással kiválasztott és az alanin­szkenneléssel előállított daunomicin–peptid-konjugátumok szerkezetének sematikus ábrája

Zhang és munkatársai bizonyos vastagbél­ráksejtekre (HT-29) szelektív heptapeptideket (7 aminosav-tagszámú peptidet) kerestek fágbemutatásos eljárással. Három szelekciós ciklus után véletlenszerűen kiválasztott 50 klónt vizsgálva, a ráksejtekhez legszelektívebben kötődő heptapeptid szekvenciája sorrendben a következő aminosavakból állt: valin-hisztidin-leucin-glicin-tirozin-alanin-threonin (az aminosavak három, illetve egybetűs kódjaival: Val-His-Leu-Gly-Tyr-Ala-Thr, illetve VHLGYAT). Kísérleteinkben tehát ezt az irányító peptidet kívántuk felhasználni, hogy egy kemoterápiás hatóanyagot, a daunomicint kapcsoljuk hozzá. Korábbi cikkeinkben már bemutattuk, hogy a daunomicint (Dau) könnyen és hatékonyan lehet kapcsolni aminooxiacetil-csoporttal (Aoa) módosított peptidekhez oxim-kötésen keresztül. A daunomicin a sejtekben képes a DNS kettős spirál láncai közé beékelődni (interkalálódni), ezáltal gátolva a sejtosztódást, vagyis a sejtek szaporodását. Így tudja gátolni többek között a daganatok növekedését. Azonban már azt is tudjuk, hogy a szabad Dau nem szabadul fel az oxim-kötésből, hanem egy olyan metabolitja keletkezik a sejtekben, amely tartalmazza a daunomicint, az aminooxiacetil-részt (Aoa; =N-O-CH2-CO-) és azt az aminosavat, amelyhez az Aoa kapcsolódik (Dau=Aoa-Aaa-OH, ahol az Aaa-OH a szabad α-karboxilcsoportot tartalmazó adott aminosavat jelenti). Azt is bizonyítottuk, hogy a metabolit kötődési képessége a DNS-hez jelentősen függ a benne jelenlévő aminosav típusától. Tehát annak érdekében, hogy az Ala-szkennelés során ne kapjunk különböző metabolitokat, célszerű az irányító peptid és az oxim-kötött daunomicin- (Dau=Aoa) rész közé egy olyan távtartó szekvenciát (spacer) beépíteni, ami minden kialakítandó új származékban azonos és a sejtbe jutva könnyen lebomlik, mindig ugyanazt a metabolitot eredményezve. Így a konjugátumok hatása összehasonlítható és kiválasztható a legjobb irányító molekula. Ezen megfontolásokból a korábbi tapasztalataink alapján a leucinból, két argininből és egy tirozinból álló (Leu-Arg-Arg-Tyr; LRRY) tetrapeptid spacert választottuk és építettük be a konjugátumokba. Így minden esetben a legkisebb metabolit, ami a sejtben felszabadult és a hatásért felelős volt, a Dau=Aoa-Leu-OH egység volt. Mivel az irányító peptid egyik pozíciójában eredetileg is alanin volt, így ebben a helyzetben egyelőre nem végeztünk cserét, tehát a többi hat aminosav cseréjével összesen hat új konjugátumot állítottunk elő (3. ábra).  
   Ennek a hat konjugátumnak ráksejtekre gyakorolt toxikus hatását vizsgáltuk HT-29 sejteken és összehasonlítottuk a kontrollvegyület hatásával (táblázat). Az eredmények egyértelműen mutatták, hogy a szekvenciában a valin (V), a leucin (L) és a tirozin (Y) aminosavak cseréje nem megengedett. Ugyanakkor az a konjugátum, amelyben a glicint (G) cseréltük alaninra (A), hatékonyabban pusztította a ráksejteket (a kisebb IC50 értékek a nagyobb toxikus hatást szemléltetik).

Táblázat. A daunomicin–peptidkonjugátumok tumorellenes hatása

 

4. ábra. A fágbemutatással kiválasztott és az alaninszkenneléssel előállított daunomicin–peptid-konjugátumok sejtfelvételének tanulmányozása áramlási citométerrel. A) Azon sejtek aránya, amelybe bejutott a konjugátum; B) a bejutott konjugátum mennyiségével arányos fluoreszcencia intenzitás. (A G az eredeti szekvenciából készült konjugátumot jelenti, míg az X/A jelölések az adott aminosav X = treonin (T); tirozin (Y); glicin (G); leucin (L), hisztidin (H); valin (V) alaninra (A) történő cserével előállított konjugátumot jelenti)

Ennek okát az úgynevezett sejtfelvételi vizsgálatokkal (áramlási citometria és fluoreszcencia mikroszkópia segítségével) magyaráztuk, amelyek igazolták, hogy a glicin-alanin (G/A)-csere által kapott konjugátum hatékonyabban jutott be a tumorsejtekbe, mint a többi konjugátum (4– 5. ábra). 

5. ábra. A fágbemutatással kiválasztott és a glicin/alanin (G/A)-cserével előállított daunomicin–peptidkonjugátumok sejtfelvételének tanulmányozása fluoreszcens mikroszkóppal 30 perces inkubálás után. (Az intenzívebb vörös szín, ami a daunomicin színéből adódik, a sejtbe jutott nagyobb mennyiségű konjugátumot jelenti.)

Az eredmények alapján a pozíciós szkennelési eljárást a glicin helyén végeztük el (6. ábra). Tehát az alanin után további aminosavakat építettünk be ebbe a pozícióba. A vizsgált aminosavak a savas karakterű glutaminsav (Glu, E), a bázikus lizin (Lys, K), a poláris karakterű szerin (Ser, S), treonin (Thr, T) és aszparagin (Asn, N), valamint az apoláris leucin (Leu, L) és fenilalanin (Phe, F), továbbá a szerkezetben általában törést okozó ciklikus prolin (Pro, P) voltak.
    A korábbi vizsgálatokhoz hasonlóan végzett kísérletek alapján megállapíthattuk, hogy a prolin és a lizin beépítése ebbe a pozícióba nem célszerű. A glutaminsav, szerin, treonin és aszparagin (E, S, T, N) esetében nem tapasztaltunk szignifikáns változást az alaninnal módosított konjugátum hatékonyságához képest. Ellenben, ha nagy apoláris oldalláncot tartalmazó aminosavat fenilalanin vagy leucin (F, L) építettünk be a glicin helyére, akkor még erősebb tumorellenes hatású konjugátumokhoz jutottunk. Ezeket a hatásbeli különbségeket szintén igazolni tudtuk a sejtfelvételi adatokkal. Tehát, amelyik anyag már kis koncentrációban is hatékonyabban bejut a ráksejtekbe, az jobban pusztítja azokat, míg az a konjugátum (prolint (P) tartalmazó), amely még magasabb koncentrációban is csak kis mértékben jut be a sejtekbe, az kevéssé hat a ráksejtekre. Összességében elmondhatjuk, hogy a fágbemutatásos eljárással kiválasztott peptid felhasználásával készült konjugátumhoz képest egy nagyságrenddel jobb hatású konjugátumot sikerült előállítanunk.

6. ábra. A pozíciós szkenneléssel előállított daunomicin–peptidkonjugátumok szerkezetének sematikus ábrája és a konjugátumok tumorellenes hatása (IC 50 értékek) HT-29 humán vastagbél-tumorsejteken (az értékek μM-ban értendők)

Vizsgálati eredményeink azt mutatják, hogy a fágbemutatásos eljárás alkalmas lehet tumorspecifikus irányító molekulák kiválasztására. Azonban célszerű az így nyert szekvencia módosításával kísérletezni még hatékonyabb vegyületek előállítása érdekében. Mindezek az apró lépések közelebb hozhatják egy hatékony, sokrétű, személyre szabott rákgyógyítás megvalósítását. Q

A cikkben használt egy- és hárombetűs aminosav-kódok és további rövidítések jelentése:

alanin: A (Ala); aszparagin: N (Asn); arginin: R (Arg); glicin: G (Gly); hisztidin: H (His); leucin: L (Leu); lizin: K (Lys); szerin: S (Ser); fenilalanin: F (Phe); tirozin: Y (Tyr); treonin: T (Thr); valin: V (Val); aminooxiecetsav (Aoa); daunomicin (Dau).

Irodalom

Mező, G. (2011) Célzott tumorterápia peptidekkel. Természet Világa 142, 555-558.

Mező, G., Hegedüs, R. Szabó, I. (2012) Célzott tumorterápia. Természet Világa 143, 448-451.

Mező, G., Enyedi K.N. (2015) Egy anyag – két célpont. Lehetőségek a célzott daganatterápiában. Természet Világa 146, 307-310.

Rivinoja, A., Laakkonen, P. (2011) Identification of homing peptides using the in vivo phage display technology. Methods Mol. Biol. 683, 401-415.

Zhang Y., és mtsai. (2007) Panning and identification of a colon tumor binding peptide from a phage display peptide library. J. Biomol. Screen. 12, 429-435.

Orbán, E., Mező, G., és mtsai. (2011) In vitro degradation and antitumor activity of oxime bond-linked daunorubicin-GnRH-III bioconjugates and DNA-binding properties of daunorubicin-amino acid metabolites. Amino Acids 41, 469-483.

Kiss, K., Szabó, R., Mező, G. (2016) Modification of peptide srquence selected for HT-29 colon cancer cell line by phage display to increase the anti-tumour activity of conjugates developed for targeted tumour therapy. J Pept. Sci. 22(52S), 183.